Bizonyos tárgyak nem engedélyezettek a múzeumban a biztonság és a műalkotások megőrzése érdekében. A tiltott tárgyak közé tartoznak, de nem kizárólagosan:
A Vatikáni Múzeumokban ingyenes ruhatári szolgáltatás áll rendelkezésre, ahol elhelyezhetők a tiltott tárgyak.
*A vakvezető kutyákat pórázon és szájkosárral kell vinni, a terápiás háziállatok pedig csak igazolással léphetnek be.
A Vatikáni Múzeumokban a látogatóknak szerényen kell öltözködniük, a vállakat és a térdeket takarva. Az ujjatlan felsők, rövidnadrágok, miniszoknyák és kalapok nem megfelelőek.
A látogatóknak kerülniük kell a túl sok bőr megmutatását; a Vatikánban és a múzeumokban szerény öltözködés az elvárás. A vállak, a derék vagy a lábak túlzott bőrének felfedése nem megengedett.
A Vatikáni Múzeumokba való belépéskor a dekoltázs mutogatása nem számít megfelelő öltözéknek. A hely szakrális jellegének tiszteletben tartása érdekében szerény ruházatot kell viselni.
A Vatikáni Múzeumokba a farmernadrágok elfogadhatóak, feltéve, hogy nem rongyosak és nem leleplezőek. A látogatóknak biztosítaniuk kell, hogy a farmert olyan szerény felsővel párosítsák, amely eltakarja a vállakat és a mellkast.
Kisebb hátizsákok és kézitáskák a Vatikáni Múzeumokban engedélyezettek, de biztonsági ellenőrzésnek vethetik alá őket. A nagy táskákat és bőröndöket a ruhatárban kell ellenőrizni.
Éles tárgyak, fegyverek, esernyők, üvegedények és alkohol fogyasztása tilos. A teljes lista megtekintéséhez célszerű áttanulmányozni az irányelveket.
A Vatikáni Múzeumokban a személyes használatra történő fényképezés megengedett, de a vakuval és állvánnyal történő fényképezés tilos.
A Sixtus-kápolnában szigorúan tilos a fényképezés és a videózás a művészet és a tisztelet légkörének megőrzése érdekében.
A látogatók a Vatikáni Múzeumba vizes palackokat is behozhatnak, azonban ajánlott, hogy azok műanyagból készültek és zárhatóak legyenek, hogy a műtárgyak és a helyiségek ne sérüljenek.
Bár a Vatikánba való belépéskor nem kell hivatalos vámvizsgálaton átmennie, a Vatikáni Múzeumba való belépéskor a repülőtéri biztonsági ellenőrzéshez hasonló biztonsági ellenőrzésre kerül sor.
