Certos itens não são permitidos dentro do museu para garantir a segurança e a preservação das obras de arte. Os itens proibidos incluem, mas não se limitam a:
Existe um bengaleiro gratuito disponível nos Museus do Vaticano onde é possível deixar pertences proibidos.
*Cães-guia devem ser levados com trela e açaime, e animais de terapia só serão permitidos com um certificado.
Os Museus do Vaticano exigem que os visitantes se vistam de forma modesta, com os ombros e os joelhos cobertos. Os tops sem mangas, os calções, as mini-saias e os chapéus não são apropriados.
Os visitantes devem evitar mostrar demasiada pele; espera-se que se vistam com recato na Cidade do Vaticano e nos Museus. Não é permitida a exposição dos ombros, da barriga ou da pele excessiva das pernas.
A exibição de decotes não é considerada vestuário apropriado para entrar nos Museus do Vaticano. Devem ser usadas roupas modestas para respeitar a natureza sagrada do local.
As calças de ganga são aceitáveis nos Museus do Vaticano, desde que não sejam rasgadas ou reveladoras. Os visitantes devem combinar as calças de ganga com um top modesto que cubra os ombros e o peito.
São permitidas pequenas mochilas e bolsas de mão nos Museus do Vaticano, mas podem ser sujeitas a um controlo de segurança. Os sacos e malas de grandes dimensões devem ser controlados no bengaleiro.
Objectos cortantes, armas, guarda-chuvas, recipientes de vidro e álcool não são permitidos no interior. Para obter uma lista completa, é aconselhável rever as diretrizes.
É permitido tirar fotografias para uso pessoal nos Museus do Vaticano, mas é proibido o uso de flash e tripés.
A fotografia e a videografia são estritamente proibidas no interior da Capela Sistina para preservar a arte e a atmosfera de reverência.
Os visitantes podem trazer garrafas de água para os Museus do Vaticano; no entanto, recomenda-se que sejam de plástico e que possam ser seladas para evitar danos nas obras de arte e nas instalações.
Embora não passe pela alfândega formal ao entrar na Cidade do Vaticano, será efectuado um controlo de segurança semelhante ao de um aeroporto à entrada dos Museus do Vaticano.